Mit einem hochaffinen, Fluorophor-konjugierten Nanobody zur Detektion von Zielproteinen wurden nun Zielstrukturen in Zellen hoch effizient markiert.
Deutsche Wissenschaftler haben eine neue Strategie zur nahezu vollständigen Markierung zellulärer Strukturen für die hochauflösende Mikroskopie entwickelt. In einer Studie, die jetzt in Nature Communications veröffentlicht wurde, verwendeten die Experten am NMI in Reutlingen, am Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie (MPIterMic) in Marburg und an der Universität Tübingen einen hochaffinen, Fluorophor-konjugierten Nanobody zur Detektion von Zielproteinen, die eine kurze und nicht-störende Peptid-Sequenz (Peptid-Tag) tragen. Damit werden Zielstrukturen in Zellen hoch effizient markiert und lassen sich mit geringstem räumlichen Abstand optisch auflösen.
dSTORM – zelluläre Strukturen im Nanometerbereich darstellen
Die direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) ist eine hochauflösende Lichtmikroskopie-Technik, mit der sich zelluläre Strukturen im Nanometerbereich darstellen lassen. Allerdings ist das Auflösungsvermögen von dSTORM bis heute durch die Qualität der Fluoreszenzmarkierung begrenzt, da nur strukturelle Details dargestellt werden, die ein Fluorophor tragen. Folglich müssen biologische Strukturen möglichst dicht und vollständig markiert (gelabelt) werden. Bisherige Verfahren führen jedoch häufig zu funktionellen Störungen der zu visualisierenden Strukturen bzw. erreichen nicht die nötige Markierungsdichte.
In einer Kooperation zwischen Prof. Dr. Rothbauer von der Universität Tübingen und dem NMI in Reutlingen und Dr. Ulrike Endesfelder vom Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie in Marburg entwickelten die Wissenschaftler eine neue Markierungsstrategie für die Bildgebung mit dSTORM. Auf Grundlage ihrer Expertise auf dem Gebiet der Nanobodys (kleine einzelkettige Antikörper mit einer Größe von ca. 2 x 4 nm) und der Einzelmolekül-Mikroskopie entwickelten die Wissenschaftler den ersten bivalenten Nanobody, der einen zwölf Aminosäuren langen Peptid-Tag bindet.
Sie zeigten, dass dieser Nanobody hoch spezifisch und mit hoher Affinität den kurzen Peptid-Tag bindet. Koppelt man nun den Peptid-Tag an zelluläre Zielstrukturen, lassen sich diese mit dem Fluorophor-gekoppelten Nanobody besonders dicht markieren. Damit werden die derzeitigen Standards zur Probenmarkierung für die hochauflösende Bildgebung mittels dSTORM deutlich übertroffen.
„Die Bindungseigenschaften dieses neuen Nanobodys haben unsere Erwartungen bei weitem übertroffen. Die Bildqualität, die wir erreichen können, ist wirklich beispiellos“, berichtete Björn Tränkle, einer der Erstautoren der Studie. Am Beispiel verschiedenster struktureller und nicht-struktureller Proteine konnten die Wissenschaftler zeigen, dass der Peptid-Tag deren Funktion und Lokalisierung nicht beeinträchtigt. Darüber hinaus konnten sie ihre Markierungsstrategie auch in lebenden Zellen und zur Verfolgung von einzelnen Molekülen (single particle tracking) anwenden.
„Mit diesem neuen Tag können wir endlich Proteine beobachten, die mit anderen Tags nicht richtig funktionieren“, so David Virant, ebenfalls Erstautor der Studie. „Ich bin zuversichtlich, dass dieses universelle Markierungssystem einen großen Einfluss auf diesem Forschungsgebiet haben wird, da es vielen Gruppen nun erst möglich sein wird, interessante Proteine mittels hochauflösender Mikroskopie zu untersuchen.”
Originalpublikation:
David Virant∗, Bjoern Traenkle∗, Julia Maier, Philipp D. Kaiser, Mona Bodenhoefer, Christian Schmees, Ilijana Vojnovic, Borbála Pisak-Lukáts, Ulrike Endesfelder§, Ulrich Rothbauer§ (2018) A peptide tag-specific nanobody enables high-quality labeling for dSTORM imaging.
Nature Communications, DOI: 10.1038/s41467-018-03191-2. ∗Authors contributed equally. §Corresponding authors.
